质粒大量抽提试剂盒(通用型)

使用说明：
1. 取过夜菌至50毫升离心管内，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。
通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清，再倒入约50毫升菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量一般不能超过150毫升，对于低拷贝质粒所用菌量一般不能超过200毫升。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。
2. 每管加入5毫升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。
确认溶液I中已经添加了RNase A。最高速度vortex 5-10秒或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开或用手指把沉淀弹开。
3. 每管加入5毫升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，室温放置1-2分钟，使细菌完全裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后，溶液应变得透明，无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，再室温放置2-3分钟，但总裂解时间不可超过5分钟。
4. 每管加入7毫升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。
切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致最终所得质粒的质量下降。
5. 12,000-14,000rpm室温离心10分钟。
如果离心机的最高速度较低，例如约5000-6000rpm时，需要适当延长离心时间，例如20-30分钟，直至沉淀充分。离心时可以准备好质粒纯化柱，自制漏斗等，并在纯化柱上标上记号。
6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。12,000-14,000rpm离心2分钟，倒弃收集管内液体。
质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。本步骤及后续需要12,000-14,000rpm离心2分钟的步骤，如果离心机的最高速度较低，需要适当延长离心时间，例如约5000-6000rpm时需要离心约5分钟或更长时间，直至液体全部穿柱。如果离心后有少量漂浮物，可以考虑再次离心，或者使用擦镜纸两次对折后打开形成的自制漏斗，以过滤去除漂浮物。
7. (可选做)在质粒纯化柱内加入10毫升溶液PB，12,000-14,000rpm离心2分钟，洗去核酸酶污染等杂质，倒弃收集管内液体。
本步骤对于从EndA⁺菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101等中提取质粒并去除核酸酶污染是必须的，对于从其它任何具有较高核酸酶表达水平和糖类修饰水平的菌株中提取质粒也是非常必须的。参考图1，对于一些常用的EndA^-菌株如DH5α和XL-1 blue等如果后续仅用于酶切、PCR、反转录等常规分子生物学操作，并不需要本步骤。如果抽提获得的质粒用于细胞转染，宜增加本步骤。
8. 在质粒纯化柱内加入12毫升溶液IV，12,000-14,000rpm离心2分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体。
加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。
9. 12,000-14,000rpm再次离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。
10. 将质粒纯化柱置于洁净50毫升离心管上，加入2毫升溶液V至管内柱面上，放置2分钟。
也可以用重蒸水或 Milli-Q级纯水替代溶液V，但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。如想得到较高浓度的质粒，可以加入1毫升溶液V洗脱，质粒得率实测减少约5-10%，具体减少量与特定样品有关。
11. 12,000-14,000rpm离心2分钟，所得液体即为高纯度质粒。
通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml左右。如果想得到高浓度的质粒，
采用如下的异丙醇沉淀方法浓缩质粒或常规的乙醇沉淀方法。
a. 加入0.7倍体积的常温异丙醇(例如1毫升待浓缩质粒中加入0.7毫升异丙醇)，混匀后1,2000-14,000rpm 4℃离心10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀。
如果希望获得较高浓度的质粒，在洗脱时推荐采用1毫升洗脱液进行洗脱，后续可以转移到2毫升离心管内进行异丙醇沉淀，这样操作起来相对比较方便。异丙醇沉淀的DNA为玻璃状近透明的颗粒状沉淀，和乙醇沉淀产生的含盐沉淀物相比较难观察清楚。离心后取放离心管要尽量轻柔，避免沉淀松动或部分颗粒状悬浮至溶液中。不推荐直接倒弃上清，直接倒弃上清时经常出现直接把质粒沉淀倒掉的情况；如果偏好直接倒弃上清，建议把上清倒弃至一洁净离心管内，这样万一沉淀被倒出，仍然可以从洁净离心管中回收。推荐用移液枪吸去上清，并注意尽量避免吸走沉淀。
b. 加入1毫升常温70%乙醇溶液，轻轻悬起质粒沉淀以充分洗涤，12,000-14,000rpm 4℃离心5-10分钟，小心吸去上清液，避免触及沉淀。
c. 5,000-10,000rpm 4℃离心5-10秒，用20微升或200微升移液器小心吸净残留液体，避免触及沉淀。
d. 肉眼观察无明显液体后(吸净液体后通常在1分钟内即可完成干燥)，加入适当体积的溶液(如溶液V、10mM Tris-Cl pH8.5或Milli-Q级纯水)溶解DNA。
DNA样品不能过于干燥，否则很难溶解。最好在弱碱性条件下溶解DNA，溶解时可用缓冲液反复冲洗管壁，使管壁上的DNA充分溶解。
附表1. EndA^- and EndA⁺ strains of E. coli.